El tratamiento de heridas crónicas es un desafío, y el desarrollo de diferentes formulaciones basadas en insulina ha demostrado eficacia debido a su capacidad para regular el estrés oxidativo y las reacciones inflamatorias. La formulación de insulina con polisacáridos en sistemas de hidrogel biohíbrido tiene la ventaja de combinar sinérgicamente la bioactividad de la proteína con la biocompatibilidad y las propiedades de hidrogel de los polisacáridos. En este estudio, se preparó y caracterizó una formulación de hidrogel que contiene insulina, quitosano y metilcelulosa hidroxipropilada (Chi/HPMC/Ins) mediante análisis de FTIR, termogravimetría y punto de gel. La viabilidad celular in vitro y el potencial de migración celular del hidrogel Chi/HPMC/Ins se evaluaron en células queratinocíticas humanas (HaCat) mediante ensayos de MTT y de rascado de heridas. El hidrogel se aplicó en heridas de espesor completo por excisión en ratones diabéticos durante veinte días para estudios in vivo. Los estudios de viabilidad celular indicaron que el hidrogel Chi/HPMC/Ins no era citotóxico. Además, el hidrogel Chi/HPMC/Ins promovió un cierre más rápido de la brecha en el ensayo de rascado. In vivo, las heridas tratadas con el hidrogel Chi/HPMC/Ins resultaron en un cierre más rápido de la herida, la formación de un tejido de granulación más organizado y la regeneración de folículos pilosos. Estos resultados sugieren que los hidrogeles Chi/HPMC/Ins podrían promover la cicatrización de heridas in vitro e in vivo y podrían ser un nuevo apósito potencial para la cicatrización de heridas.