El estrés por frío limita la productividad del pepino, y el injerto en portainjertos tolerantes ofrece una estrategia prometedora para mejorar la resiliencia. Este estudio comparó las respuestas de injertos heterogéneos y autoinjertos expuestos a diferentes temperaturas frías, con el objetivo de descubrir la base molecular de la tolerancia mediada por injertos. Las observaciones morfológicas mostraron que injertar en portainjertos de la variedad X cv. Tetsukabuto mejoró el crecimiento de las plantas bajo frío moderado, mientras que el estrés extremo seguía siendo letal. El análisis del transcriptoma reveló que los injertos heterogéneos mostraron un mayor número de genes diferencialmente expresados y más sostenidos que los autoinjertos. La enriquecimiento de la ontología genética (GO) en injertos heterogéneos indicó una activación temprana de procesos estructurales, regulatorios y metabólicos, con un enriquecimiento continuo en etapas posteriores. El análisis de KEGG destacó la señalización de hormonas vegetales como una vía central modulada por el injerto heterogéneo, con regulación selectiva de la señalización de auxina, etileno y ABA. Los injertos heterogéneos activaron reguladores clave, incluyendo -like, , y que se expresaron fuertemente, junto con factores de transcripción de las familias NAC, CAMTA, WRKY y MYB, sugiriendo una regulación coordinada de las redes de respuesta al frío. Estos resultados demuestran que el injerto heterogéneo mejora la tolerancia al frío al orquestar respuestas moleculares en múltiples capas, incluyendo la modulación hormonal, la señalización de estrés y factores de transcripción. Esto subraya el potencial del injerto en portainjertos tolerantes al frío como una estrategia práctica para el cultivo de pepinos en entornos propensos al frío.