Hay una alta incidencia de fracaso y recurrencia en heridas crónicas de la piel tras terapias convencionales. Para promover la cicatrización, se ha propuesto el uso de sustitutos de piel que contengan células vivas como apósitos. El objetivo de este estudio fue producir un sustituto de piel ingenierizado en capas, basado en células y sin andamiaje, que contenga fibroblastos y queratinocitos vivos, adecuado para su uso como apósito, considerando el tiempo de producción, el esfuerzo de manejo durante el proceso de fabricación y la estabilidad del producto final. Se utilizó el método de autoensamblaje, que se basa en la capacidad de las células mesenquimatosas para secretar y organizar una lámina de tejido conectivo que sostiene el crecimiento de queratinocitos, para producir los sustitutos de piel (TES). Se probaron tres densidades de siembra de fibroblastos para producir láminas de tejido. En el día 17, se añadieron queratinocitos sobre 1 o 3 láminas de tejido apiladas (método de referencia). Cuatro días después, los TES fueron sometidos a 4, 10 o 17 días de cultivo en la interfaz aire-líquido (A/L). Todos los TES resultantes fueron comparables en términos de su aspecto histológico, perfil de expresión de proteínas y comportamiento contráctil in vitro. Sin embargo, se observaron signos de digestión de la matriz extracelular (MEC) que progresaron con el tiempo de cultivo en los TES producidos con solo una lámina de tejido derivada de fibroblastos. Con una menor densidad de fibroblastos, la MEC de los TES fue casi completamente digerida después de 10 días A/L y perdió integridad histológica tras el injerto en ratones atímicos. Aumentar la densidad de siembra de fibroblastos de 5 a 10 veces resolvió este problema. Concluimos que el método propuesto permite la producción de un TES vivo en 25 días, que retiene sus características histológicas in vitro durante al menos dos semanas.