La sociedad muestra una creciente preocupación por el bienestar de los cetáceos en cautiverio, así como por los cetáceos en la naturaleza amenazados por disturbios antropogénicos. El estudio de la respuesta de estrés fisiológico se está utilizando cada vez más para abordar cuestiones de conservación y bienestar de los cetáceos. Dentro de esto, una técnica recién descrita para extraer cortisol de la descamación epidérmica puede servir como una medida no invasiva y más integrada de la respuesta al estrés y el bienestar de un cetáceo. Sin embargo, los factores confusos son comunes al medir hormonas glucocorticoides. En este estudio, validamos un protocolo de extracción de hormonas esteroides y el uso de un ensayo inmunoenzimático (EIA) comercial para medir las concentraciones de cortisol en muestras epidérmicas de delfín mular y beluga. Además, examinamos el efecto de la masa de la muestra y la ubicación corporal en las concentraciones de cortisol. Las pruebas de validación (es decir, especificidad del ensayo, precisión, exactitud y sensibilidad) sugirieron que el método era adecuado para la cuantificación de las concentraciones de cortisol. El cortisol se extrajo de muestras pequeñas (0.01 g), pero la cantidad de cortisol detectada y la variabilidad entre extracciones duplicadas aumentaron a medida que disminuyó la masa de la muestra. En los delfines mulares, las concentraciones de cortisol en la piel epidérmica no variaron significativamente entre las ubicaciones del cuerpo, mientras que hubo un efecto significativo del individuo. En general, presentamos una contribución para avanzar y estandarizar las evaluaciones hormonales en la epidermis de los cetáceos.