La tinción histoquímica de muestras de hueso descalcificado embebidas en parafina se utiliza comúnmente en la investigación preclínica de enfermedades musculoesqueléticas, permitiendo la visualización de múltiples componentes de tejido mediante la aplicación de cromógenos. El propósito de este estudio fue introducir un novedoso protocolo de tinción multicolor que implica reactivos químicos y procedimientos optimizados, permitiendo la identificación de hueso altamente mineralizado, callo de fractura poco mineralizado, cartílago y fibras musculares esqueléticas simultáneamente. Las muestras de fémur fracturado y vértebras de cola sanas de ratas macho Sprague-Dawley adultas fueron descalcificadas con EDTA y ácido fórmico, respectivamente, seguido de embebido en parafina, seccionado de tejido y tinción multicolor. Se llevaron a cabo tinciones convencionales de pentacromo de Movat y safranina O / verde rápido en paralelo para comparación. La tinción inmunohistoquímica de colágeno tipo X y análisis de micro-CT se incluyeron para validar la eficacia del método de tinción. La tinción multicolor permitió la visualización de los principales componentes de tejido musculoesquelético en ambos tipos de muestras descalcificadas, proporcionando resultados de calidad con menos reactivos químicos y procedimientos simplificados. La tinción inmunohistoquímica demostró su capacidad para la identificación del proceso de osificación endocondral durante la curación de fracturas. La imagen de micro-CT validó el resultado de tinción para tejido esquelético altamente mineralizado. La aplicación de la tinción multicolor puede facilitar futuras investigaciones preclínicas que involucren muestras embebidas en parafina descalcificadas.