Validación de un novedoso método de PCR cuantitativo de doble control para cuantificar la integración fuera del objetivo del transgen después de la modificación del ADN inducida por CRISPR
Autores: Schjeide, Brit-Maren Michaud; Schenke, Maren; Seeger, Bettina; Püschel, Gerhard Paul
Idioma: Inglés
Editor: MDPI
Año: 2022
Acceso abierto
Artículo científico
2022
Validación de un novedoso método de PCR cuantitativo de doble control para cuantificar la integración fuera del objetivo del transgen después de la modificación del ADN inducida por CRISPR
Categoría
Ingeniería y Tecnología
Subcategoría
Bioingeniería
Palabras clave
Potencia
Toxina botulínica
CRISPR/Cas9
Dc-qcnPCR
Integraciones fuera del objetivo
ADN donante
Licencia
CC BY-SA – Atribución – Compartir Igual
Consultas: 64
Citaciones: Sin citaciones
Para mejorar un ensayo celular recientemente establecido para evaluar la potencia de la neurotoxina botulínica, se modificaron las células SiMa derivadas de neuroblastoma y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para incorporar la secuencia de codificación de una luciferasa reportera en un lugar seguro genético utilizando CRISPR/Cas9. Se desarrolló un nuevo método, la PCR cuantitativa de número de copias de doble control (dc-qcnPCR), para detectar integraciones fuera del objetivo del ADN donante. La tasa de éxito de la inserción del ADN donante y la tasa de éxito de la inserción dirigida se analizaron en clones de cada tipo celular. La dc-qcnPCR cuantificó de manera confiable el número de copias en ambas líneas celulares. La probabilidad de integración incorrecta del ADN donante aumentó significativamente en las células SiMa en comparación con las iPSC. Esto posiblemente se pueda explicar por la menor expresión génica relativa agrupada de varios genes de reparación de doble cadena (, , , , , y ) en los clones de SiMa que en los clones de iPSC. La dc-qcnPCR ofrece un método eficiente y rentable para detectar integraciones fuera del objetivo del ADN donante inducidas por CRISPR/Cas9.
Descripción
Para mejorar un ensayo celular recientemente establecido para evaluar la potencia de la neurotoxina botulínica, se modificaron las células SiMa derivadas de neuroblastoma y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para incorporar la secuencia de codificación de una luciferasa reportera en un lugar seguro genético utilizando CRISPR/Cas9. Se desarrolló un nuevo método, la PCR cuantitativa de número de copias de doble control (dc-qcnPCR), para detectar integraciones fuera del objetivo del ADN donante. La tasa de éxito de la inserción del ADN donante y la tasa de éxito de la inserción dirigida se analizaron en clones de cada tipo celular. La dc-qcnPCR cuantificó de manera confiable el número de copias en ambas líneas celulares. La probabilidad de integración incorrecta del ADN donante aumentó significativamente en las células SiMa en comparación con las iPSC. Esto posiblemente se pueda explicar por la menor expresión génica relativa agrupada de varios genes de reparación de doble cadena (, , , , , y ) en los clones de SiMa que en los clones de iPSC. La dc-qcnPCR ofrece un método eficiente y rentable para detectar integraciones fuera del objetivo del ADN donante inducidas por CRISPR/Cas9.