Un sistema de marcadores validado es crucial para llevar a cabo un programa de mejoramiento asistido por genómica efectivo. Utilizamos 36 marcadores de PCR específica de alelos competitivos (KASP) para genotipar 376 clones de la línea de yuca biofortificada, y se caracterizaron 93 de estos clones con marcadores DArTseq para caracterizar los materiales de mejoramiento y evaluar sus relaciones. La capacidad discriminativa de los 36 marcadores de control de calidad (QC) KASP y 6602 marcadores DArTseq se evaluó utilizando 92 clones genotipados en ambos ensayos. Además, se utilizaron marcadores específicos de rasgos para determinar la presencia o ausencia de regiones genómicas objetivo. El agrupamiento jerárquico identificó dos grupos principales, y los clústeres fueron consistentes con los orígenes del programa de mejoramiento. Hubo una diferenciación genética moderada y un bajo grado de variación entre los grupos identificados. La estructura general de la población fue similar utilizando ambos ensayos. Sin embargo, los marcadores KASP tuvieron una mala resolución a la hora de diferenciar los genotipos según las fuentes de semillas y sobreestimaron la prevalencia de duplicados. Los marcadores vinculados a rasgos no lograron un rendimiento óptimo, ya que todos los marcadores mostraron niveles variables de falsos positivos y/o falsos negativos. Estos hallazgos representan el primer paso en la aplicación del mejoramiento asistido por genómica para la línea de yuca biofortificada, y guiarán el uso de la selección genómica en el futuro.