La PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) es un método ampliamente utilizado para estudiar alteraciones en la expresión génica tras infecciones causadas por diversos patógenos como los virus. Los virus de ARN de cadena sencilla (ss(+)) de sentido positivo constituyen una parte importante de todos los virus vegetales conocidos, y algunos de ellos son patógenos dañinos de cultivos agrícolas importantes. El análisis de la expresión génica tras la infección por virus de ARN ss(+) es crucial para la identificación de posibles factores antivirales. Sin embargo, se sabe que las infecciones virales afectan globalmente la expresión génica y, por lo tanto, la selección y validación de genes de referencia para RT-qPCR es particularmente importante. En este estudio, se estudió la expresión de genes de referencia comúnmente utilizados para RT-qPCR tras la infección única por 11 virus de ARN ss(+), incluyendo cinco tobamovirus, cuatro potyvirus, un potexvirus y un polerovirus. La estabilidad de la expresión génica se analizó en paralelo mediante cuatro algoritmos comúnmente utilizados: geNorm, NormFinder, BestKeeper y Delta CT, y finalmente se utilizó RefFinder para resumir todos los datos. Los genes de referencia con mayor estabilidad de expresión diferían significativamente entre los virus, incluso cuando esos virus eran del mismo género. Nuestro estudio destaca la importancia de la selección y validación de genes de referencia ante diferentes infecciones virales.