La mastitis, una de las enfermedades más comunes en el ganado lechero, causa pérdidas severas en el sector lácteo a nivel mundial y afecta el bienestar animal. La enfermedad se caracteriza por una reacción inflamatoria de la glándula mamaria y es causada principalmente por infecciones bacterianas, incluyendo tanto bacterias Gram-negativas como Gram-positivas. La liberación de endotoxinas asociadas a la lisis bacteriana es un factor importante en el curso clínico de la mastitis asociada a Gram-negativos y debe ser considerada al usar antibióticos en el tratamiento de estas infecciones. Por lo tanto, la detección de endotoxinas en muestras de leche sería de ayuda en el manejo de la mastitis bovina. Con este objetivo, hemos validado un ensayo turbidimétrico cinético basado en lisado de amebocitos de Limulus (LAL) para la cuantificación de endotoxinas en muestras de leche. El ensayo fue adaptado a esta matriz particular incorporando filtración y dilución de las muestras de leche en el procedimiento. Nuestros resultados demuestran la robustez y utilidad del ensayo, que permite la identificación de mastitis coliforme en muestras de leche de vacas afectadas y la cuantificación de la actividad de endotoxinas en muestras de leche a granel y comercial. Se requieren más estudios para evaluar el rendimiento del ensayo en muestras de leche de mastitis asociadas a bacterias Gram-negativas distintas, así como durante el curso clínico de estas mastitis Gram-negativas o después de su tratamiento con antibióticos.