Muchos fluorocromos utilizados rutinariamente en el análisis de la calidad del semen emiten en los canales verde y rojo, limitando su posible combinación para el análisis de múltiples parámetros. El uso de fluoróforos que emiten en diferentes canales de luz amplía las posibilidades de combinación para expandir el rango de criterios evaluados simultáneamente. Esto es de gran interés en casos de volúmenes eyaculados pequeños, como los que ocurren naturalmente en gallos, razas de perros pequeños y drones. El propósito de este experimento es establecer el Calceín Violeta (CaV), un fluorocromo azul, como un marcador de viabilidad e integridad acrosomal en animales domésticos para liberar los canales rojo y verde. Se utilizó SYBR14/Yoduro de Propidio (PI) como colorante de referencia, muestras tratadas térmicamente como controles negativos, combinación de tinción en serie para validación y microscopía de epifluorescencia para la observación. Los espermatozoides muertos marcados en rojo con PI no mostraron fluorescencia azul ni en la cabeza ni en la cola. Los espermatozoides vivos mostraron una emisión azul decreciente de la cabeza a la cola cuando se tiñeron únicamente con CaV. Los acrosomas no reaccionados mostraron una intensa fluorescencia azul independientemente de la integridad de la membrana plasmática. Esto necesita ser confirmado más a fondo para especies con cabezas pequeñas y difíciles de observar. El establecimiento de CaV como un marcador de integridad de membrana mediante microscopía de fluorescencia es un primer paso decisivo hacia un mayor desarrollo técnico y uso con citometría de flujo.