Se han desarrollado cepas auxotróficas para abordar el problema del crecimiento excesivo en la transformación genética de plantas; sin embargo, su aplicación sigue siendo limitada. Aquí, generamos nuevas cepas auxotróficas de histidina y leucina de EHA105, a saber, EHA105hisD- y EHA105leuA-, así como una cepa auxotrófica dual EHA105hisD-leuA-, a través de la eliminación de genes. La eficiencia de expresión transitoria y la tasa de supervivencia de estas tres cepas auxotróficas se vieron significativamente afectadas, pero se pudieron restaurar a los niveles del tipo salvaje EHA105 mediante la suplementación con concentraciones adecuadas de los aminoácidos correspondientes (CAA). El uso de estas tres cepas auxotróficas para la transformación genética resultó en una reducción significativa del crecimiento excesivo y logró una eficiencia de transformación comparable a la del tipo salvaje EHA105, cuando se suministraron concentraciones exógenas adecuadas de los CAA durante la etapa de co-cultivo. Además, a través de experimentos de incubación en varias plantas y suelos, se confirmó que la incidencia de células sobrevivientes de estas tres cepas auxotróficas era mucho menor que la observada para el tipo salvaje EHA105. En resumen, este estudio informa sobre las características de las nuevas cepas auxotróficas junto con el uso efectivo de tales cepas auxotróficas en la transformación genética de plantas.