El ácido lactobiónico (LBA) es un compuesto bioactivo que se ha vuelto cada vez más popular en medicina en los últimos años debido a sus propiedades únicas. Este químico puede formarse a través de la oxidación enzimática de la lactosa utilizando enzimas oxidoreductasas fúngicas. Este estudio tuvo como objetivo intensificar la síntesis de LBA utilizando enzimas inmovilizadas (deshidrogenasa de celobiosa de (PchCDH) y lacasa de (CuLAC)) en microesferas de quitosano. Utilizamos tres agentes de entrecruzamiento diferentes: genipina, glutaraldehído y polietilenimina para activar el quitosano. Se utilizaron las técnicas FTIR y CellDrop para caracterizar las microesferas activadas. Se utilizaron métodos cuantitativos (HPLC) y cualitativos (TLC) para determinar el LBA obtenido. Los resultados muestran que el tipo de activador utilizado influye en la eficiencia de la unión de la enzima a la matriz. Además, la cantidad de LBA formada depende del tipo de sistema utilizado. El uso de un sistema en el que una de las enzimas está inmovilizada en un portador activado por PEI (PchCDH) y la otra está libre (CuLAC) resultó ser el más óptimo, ya que produjo casi un 100% de conversión de lactosa a ácido lactobiónico. Resumiendo los datos obtenidos, el ácido lactobiónico inmovilizado en microesferas de quitosano tiene un gran potencial para aplicaciones médicas.