La zimografía es un método electroforético ampliamente utilizado para determinar las actividades proteolíticas en muestras de diversas fuentes. El método se basa en copolimerizar un sustrato proteico adecuado dentro de un gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio. Tras la separación electroforética de las muestras que contienen proteasas y un período de incubación adecuado, la degradación del sustrato puede visualizarse mediante tinción con azul de Coomassie. Los sitios de proteólisis se hacen visibles como bandas blancas sobre un fondo azul oscuro. Sin embargo, este protocolo de tinción requiere cantidades considerables de etanol y ácido acético para eliminar las moléculas de colorante no unidas. En este informe, describimos un nuevo protocolo de tinción que utiliza Ponceau S y que ofrece ventajas sustanciales en términos de usabilidad del ensayo y reducción de costos, especialmente al realizar grandes cantidades de zimogramas o en entornos con recursos limitados. Se demuestra una tinción rápida y reproducible de zimogramas con nuestro protocolo, y se muestra una cuantificación fiable de la actividad proteolítica en comparación con el procedimiento estándar de tinción con Coomassie.