La esterilidad masculina puede reducir costos y permitir una alta pureza de semilla durante la producción de semillas híbridas. Sin embargo, la aplicación comercial de la esterilidad masculina en la producción de semillas híbridas no ha sido ampliamente utilizada en tomates. La edición génica mediada por CRISPR/Cas9 puede facilitar la aceleración para la aplicación práctica de la esterilidad masculina en la producción de semillas híbridas. Aquí, mediante el uso del sistema CRISPR-Cas9, se eliminaron simultáneamente dos genes () y (), que subyacen a los dos loci estrechamente vinculados () y (), en dos líneas parentales de tomate. Los mutantes dobles generados desarrollaron hipocótilo verde debido a la deficiencia de antocianinas y mostraron una esterilidad masculina estable. Se logró una efectividad de hasta el 92% en la selección de esterilidad masculina utilizando el hipocótilo verde como marcador morfológico, y posteriormente se desarrolló una estrategia eficiente y estable de propagación de esterilidad masculina con la ayuda de la selección del marcador morfológico. Además, se produjeron semillas híbridas derivadas de - y se encontró que tenían un rendimiento, peso y tasa de germinación comparables con las semillas F1 derivadas de WT correspondientes. El sistema no solo aumentó la pureza de las semillas híbridas al 100%, sino que también facilitó su determinación rápida y rentable. Además, se descubrió que este sistema no tiene efectos secundarios evidentes en rasgos agronómicos importantes. Este estudio sugirió que nuestro sistema creado por CRISPR/Cas9 puede ser utilizado en la producción de semillas híbridas de tomate.