La continua evolución del virus de la influenza aviar subtipo H3 (AIV), que cruza la barrera interspecifica para infectar a los humanos, y el riesgo potencial de recombinación genética con otros subtipos representan serias amenazas para la industria avícola y la salud humana. Por lo tanto, la detección rápida y precisa del virus H3 es de suma importancia para prevenir su propagación. En este estudio, se desarrolló con éxito un método basado en la amplificación isoterma asistida por recombinasa de transcripción inversa en tiempo real (RT-RAA) para la detección rápida del AIV H3. Se diseñaron cebadores y sondas específicos para dirigirse al gen de hemaglutinina (HA) del AIV H3, asegurando una detección altamente específica del AIV H3 sin reactividad cruzada con otros virus respiratorios aviares importantes. Los resultados mostraron que el límite de detección del método de lectura de fluorescencia RT-RAA fue de 224 copias/respuesta dentro del intervalo de confianza del 95%, mientras que el límite de detección del método de visualización RT-RAA fue de 1527 copias/respuesta dentro del mismo intervalo de confianza. Además, se examinaron 68 muestras clínicas y los resultados se compararon con los de la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Los resultados mostraron que los resultados de RT-RAA de fluorescencia en tiempo real y RT-qPCR fueron completamente consistentes, y el valor kappa alcanzó 1, lo que indica una excelente correlación. Para la detección visual, la sensibilidad fue del 91.43%, la especificidad fue del 100%, y el valor kappa fue de 0.91, lo que también indicó una buena correlación. Además, los productos amplificados de RT-RAA pueden ser visualizados con un instrumento portátil de luz azul, lo que permite la detección rápida del AIV H3 incluso en entornos con recursos limitados. El método de detección rápida de AIV H3 RT-RAA establecido en este estudio puede satisfacer los requisitos de los laboratorios básicos y proporcionar una referencia valiosa para el diagnóstico temprano del AIV H3.