Reconocer las emociones de los animales es fundamental para su bienestar y puede llevar a una mejor relación con los humanos y el medio ambiente, especialmente en una especie tan extendida como el burro, que a menudo es propenso a problemas de bienestar. Este estudio tiene como objetivo evaluar la respuesta emocional de los burros a través de una tarea de condicionamiento operante con dos contenidos emocionales supuestamente diferentes. Específicamente, se llevó a cabo un diseño dentro de los sujetos que incluía condiciones positivas y negativas, recopilando parámetros conductuales y fisiológicos (variabilidad de la frecuencia cardíaca y VFC). Se analizaron las expresiones faciales, posturas y movimientos mediante análisis de componentes principales e índices de diversidad conductual (frecuencias, presupuestos de actividad, riqueza, Shannon y Gini-Simpson). Durante la condición positiva, ambas orejas se mantenían altas y de lado (izquierda: r = -0.793, < 0.0001; derecha: r = -0.585, = 0.011), mientras que las orejas estaban erigidas frontalmente (izquierda: r = 0.924, < 0.0001; derecha: r = 0.946, < 0.0001) durante la negativa. Esta última también se asoció con una mayor tendencia a caminar (r = 0.709, = 0.001), alejarse (r = 0.578, = 0.012), cambios más frecuentes en la posición del cuerpo (V = 0, = 0.022) y mayor complejidad conductual (V = 4, = 0.027). En cuanto al análisis de VFC, la raíz cuadrada media de las diferencias sucesivas entre latidos (rMSSD) fue significativamente menor después de la condición negativa. Estos parámetros no invasivos podrían considerarse como posibles indicadores del estado emocional de los burros.