Las tecnologías de almacenamiento de semen a baja temperatura ya se están utilizando en programas de conservación avícola, pero la calidad del material reproductivo almacenado en criobancos varía mucho y no siempre se puede utilizar con éxito para fines prácticos. Por lo tanto, es necesario mejorar las composiciones de los medios crioprotectores para mejorar su calidad. Este estudio tuvo como objetivo investigar la composición de los lípidos de membrana y carbohidratos en el citosol de los espermatozoides de gallo, para explicar el efecto dependiente de la dosis de una combinación de trehalosa y fructosa en los medios crioprotectores en la preservación de sus parámetros morfológicos y cinéticos durante la congelación/descongelación, y determinar la composición de diluyente más efectiva. Los eyaculados se recogieron de gallos Rhode Island Red (n = 10). Se evaluó la eficacia de tres diluyentes que contenían trehalosa: LCM-control (0 mM), Treh20 (9,5 mM) y Treh30 (13,4 mM). Se realizó un análisis cromatográfico de los lípidos de membrana, carbohidratos y polioles del citosol de los espermatozoides. Una disminución en el contenido de glicolípidos en las membranas plasmáticas de los espermatozoides de 2,0% en espermatozoides nativos a 1,1-1,4% (congelados/descongelados) y de fosfolípidos de 71,2% (nativos) a 70,5% (congelados/descongelados) redujo la motilidad progresiva de los espermatozoides de 65,7% en espermatozoides nativos a 12,6-27,6% (congelados/descongelados). La misma dinámica se observó para el parámetro de viabilidad de 90,4% (nativos) y 27,0-41,2% (congelados/descongelados). El diluyente Treh20, utilizando una combinación de sacáridos de fructosa (36 mM) y trehalosa (9,5 mM), preservó de manera óptima el perfil lipídico de las membranas plasmáticas y la composición del citosol de los espermatozoides de gallo congelados/descongelados, lo que afectó positivamente a los indicadores de movilidad general y progresiva y viabilidad.