El cáncer de mama se destaca como una forma de cáncer particularmente desafiante de tratar entre los diversos tipos. Los métodos de tratamiento tradicionales han sido enfoques de larga data, sin embargo, su eficacia ha disminuido con el tiempo debido a la mayor toxicidad, efectos adversos y la aparición de resistencia a múltiples fármacos. No obstante, ha surgido una solución viable a través de la adopción de una estrategia de tratamiento complementaria que utiliza sustancias naturales y la incorporación del ayuno intermitente para mejorar los resultados terapéuticos. Este estudio tuvo como objetivo evaluar la actividad anticancerígena de la timoquinona (TQ), el ayuno intermitente y su combinación utilizando métodos in vivo e in vitro. La actividad antiproliferativa de la TQ y el ayuno (restricción de glucosa/suero) se evaluaron contra las líneas celulares T47D, MDA-MB-231 y EMT6 y se compararon con líneas celulares normales (Vero) utilizando el método de ensayo colorimétrico MTT. Además, este estudio tuvo como objetivo determinar la concentración inhibitoria media (IC) de la TQ. Para el experimento in vivo, se evaluó la actividad antitumoral de la TQ y el ayuno intermitente (IF) midiendo los tamaños de los tumores utilizando un calibrador digital para determinar el cambio en el tamaño del tumor y las tasas de supervivencia. A nivel molecular, se midieron los niveles séricos de glucosa, beta-hidroxibutirato (beta-HB), leptina y factor de crecimiento insulínico-1 (IGF-1) utilizando kits estándar. Además, se midieron los niveles séricos de aspartato transaminasa (AST), alanina transaminasa (ALT) y creatinina. La inhibición de las líneas celulares de cáncer de mama fue lograda por la TQ. Tanto la TQ como el ayuno intermitente tuvieron un efecto anticancerígeno adicional contra los tumores de mama inoculados en ratones. La terapia combinada fue evaluada y se encontró que reducía significativamente el tamaño del tumor, con un cambio en el tamaño del tumor del -57.7%. Además, la combinación de TQ y IF llevó a una disminución en los niveles séricos de glucosa, IGF-1 (24.49 ng/mL) y leptina (1.77 ng/mL) mientras aumentaba el beta-hidroxibutirato en los ratones que recibieron la terapia combinada (200.86 nM) sin toxicidad en el hígado o los riñones. En los ratones que recibieron terapia combinada, la TQ y el IF trataron el cáncer de mama de manera aditiva sin causar toxicidad hepática o renal debido a la disminución de los niveles de glucosa, IGF-1 y leptina y el aumento de los niveles de beta-hidroxibutirato. Se requiere una investigación adicional para optimizar las dosis y determinar otros posibles mecanismos exhibidos por la nueva combinación.