El uso a largo plazo del herbicida global no selectivo glifosato para el control de malezas ha causado resistencia en las malezas. La sobreproducción del objetivo del glifosato, la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), es uno de los mecanismos de resistencia en las malezas. Sin embargo, pocos estudios han medido los efectos sobre los niveles de tolerancia y el contenido de metabolitos en especies de plantas modelo que sobreexpresan de las malezas. Evaluamos los niveles de resistencia de líneas transgénicas que sobreexpresan y sus efectos sobre el contenido de metabolitos utilizando el método de metabolómica tanto cuasi-dirigida como dirigida. Los resultados mostraron que el índice de resistencia promedio de las líneas transgénicas fue de 4.7 y los niveles de expresión exógena fueron de 265.3 a 532.0 veces más altos que los de la línea tipo salvaje (WT). La proteína EPSPS varió de 148.5 a 286.2 g g, lo que fue sustancialmente más alto que en la línea WT (9.1 g g). 103 metabolitos asociados con la biosíntesis de flavonas y flavonoles, el metabolismo de aminoácidos aromáticos, el metabolismo energético y la síntesis de auxinas fueron significativamente más altos en los individuos transgénicos resistentes al glifosato (R) que en los individuos WT. Los resultados del análisis cuantitativo muestran que las cantidades de piruvato, sedoheptulosa 7-fosfato y ácido glucónico en las plantas R fueron 1.1, 1.6 y 1.3 veces más altas que en las plantas WT, respectivamente. Sin embargo, los niveles de ácido cítrico y ácido glicérico fueron 0.9 veces más bajos que en las plantas WT. La abundancia de otros metabolitos en las vías glucolíticas y de fosfato de pentosa del metabolismo central del carbono fue similar en las plantas WT y transgénicas. El ácido glutámico fue significativamente más abundante en la línea transgénica que en las plantas WT. En contraste, la asparagina, la glutamina y la lisina fueron menos abundantes. Sin embargo, la concentración de otros aminoácidos no cambió significativamente. La sobreexpresión en confirió un nivel moderado de tolerancia al glifosato. Los metabolitos asociados con la biosíntesis de flavonas y flavonoles, el metabolismo de aminoácidos aromáticos y el metabolismo energético se incrementaron significativamente. Los resultados de este estudio serán útiles para evaluar la caracterización y la evaluación de riesgos de plantas transgénicas, incluida la identificación de efectos no deseados de las modificaciones transgénicas respectivas.