El estrés por sequía afecta severamente el crecimiento y la producción de alfalfa (Medicago sativa L.). Es particularmente importante analizar las redes clave de sequía en alfalfa a través de niveles fisiológicos y moleculares. Sin embargo, cómo seleccionar rápidamente germoplasma de alfalfa tolerante a la sequía y cómo dilucidar las vías moleculares de la alfalfa que responden a la sequía son temas menos estudiados. En este estudio, basándonos en nuestra investigación previa, verificamos aún más la asociación entre la heredabilidad de la sensibilidad al ABA durante la germinación de semillas y la tolerancia a la sequía de las plantas, e identificamos las vías clave de las diferencias en la tolerancia a la sequía entre las plantas sensibles al ABA (S1-0) e insensibles al ABA (S1-50) a través de RNA-seq y análisis. Los resultados mostraron que la sensibilidad al ABA en las semillas de alfalfa puede ser heredada y que las plantas insensibles al ABA durante la germinación muestran una mayor tolerancia a la sequía. Un análisis de los genes diferencialmente expresados (DEGs) reveló que la biosíntesis y señalización del ABA, el metabolismo de aminoácidos, LEA, y las vías relacionadas con la síntesis de ceras pueden ser las vías clave que se pueden utilizar para mejorar la tolerancia a la sequía en alfalfa. DEGs como X, Y, y Z pueden contribuir a la tolerancia a la sequía en la planta S1-50. El estudio confirma además que la selección con ABA en la etapa de germinación de semillas puede seleccionar líneas de alfalfa con buena tolerancia a la sequía, lo que proporciona una nueva base teórica para la crianza de alfalfa con tolerancia a la sequía. También se probó la expresión de los genes clave de alfalfa en respuesta al estrés por sequía.