En las plantas de tomate, spp. se han asociado cada vez más con varias enfermedades de marchitez y pudrición que son responsables de pérdidas severas en el rendimiento. Aquí, presentamos un ensayo de PCR en tiempo real TaqMan MGB (Minor Groove Binder) para detectar y discriminar spp. de otras especies fúngicas que afectan a las plantas de tomate. La metodología utilizada se basa en la amplificación selectiva de la región del espaciador interno transcrito (ITS) de spp. Este ensayo resultó ser altamente específico y sensible para las especies, dirigiéndose solo a los 29 aislados de los 45 aislados probados asociados a enfermedades del tomate. La sensibilidad se evaluó con diluciones seriadas de ADN genómico, con un límite de detección de 3.05 pg. También se estableció un método de cuantificación absoluta de ADN, basado en la determinación del número absoluto de copias objetivo. Finalmente, la efectividad del ensayo se validó con éxito con la detección y cuantificación de spp. en plantas de tomate potencialmente infectadas de un campo experimental y en plantas de control cultivadas en condiciones controladas. La metodología establecida permite una estimación fiable, sensible y reproducible de la acumulación en plantas de tomate infectadas, obteniendo nuevos conocimientos para el control de enfermedades y proporcionando una herramienta adicional en la selección de plantas resistentes.