Un suministro limitado y la escasez de precios de la harina de pescado con la expansión de la acuicultura hacen necesario buscar fuentes alternativas de proteínas. La harina de soja (SM) ha sido el reemplazo preferido para la harina de pescado en las dietas de peces. Sin embargo, esta sustitución, especialmente cuando se administra en altas dosis, puede mostrar un impacto adverso en la salud intestinal de los peces. Este estudio tuvo como objetivo investigar el efecto de reemplazar la harina de pescado con SM en la salud intestinal del lenguado oliva. Se llevó a cabo un ensayo de alimentación de 56 días con 450 peces juveniles (peso inicial: 6.32 +/- 0.01 g) asignados aleatoriamente a cinco dietas con reemplazo de SM en grados: 0% (FM), 12% (SM12), 24% (SM24), 36% (SM36) y 48% (SM48). Los resultados demostraron que las concentraciones de glucosa, triglicéridos totales y colesterol de lipoproteínas de baja densidad aumentaron, mientras que el contenido de proteínas totales y colesterol de lipoproteínas de alta densidad, y la actividad de lisozima disminuyeron en suero con el aumento de los niveles de SM en la dieta. Mientras tanto, la capacidad antioxidante total y la actividad de superóxido dismutasa disminuyeron significativamente en niveles de reemplazo que superaron el 24%, acompañados de una concentración elevada de malondialdehído (< 0.05). En comparación con el grupo FM, los grupos SM24, SM36 y SM48 mostraron una reducción significativa en la altura de las vellosidades (VH) y un aumento en el ancho de la lámina propia (< 0.05). El aumento de los niveles de SM en la dieta reguló al alza la expresión de genes relacionados con el estrés del retículo endoplásmico (ERS), inflamación y apoptosis, mientras que reguló a la baja las citoquinas antiinflamatorias y los genes relacionados con las uniones estrechas en el intestino (< 0.05). Hubo diferencias significativas en las abundancias de la microbiota intestinal tanto a nivel de filo como de género entre los grupos FM, SM24 y SM36 (< 0.05), pero los clústeres y la composición de la microbiota del grupo SM24 fueron más similares a los del grupo FM. En conclusión, reemplazar el 24% de la harina de pescado con SM indujo disfunción intestinal al evocar ERS, inflamación, disrupción de la barrera y disbiosis microbiana en el lenguado oliva.