Este estudio tuvo como objetivo investigar si la adición dietética de 25-OHD mejoraba el rendimiento, la calidad del huevo, los índices sanguíneos, el estado antioxidante, la morfología yeyunal y la calidad de la tibia de gallinas ponedoras envejecidas en comparación con una adición dietética de VD. Un total de 270 gallinas ponedoras Hy-Line Brown de 55 semanas de edad fueron asignadas aleatoriamente a tres tratamientos dietéticos con seis réplicas (15 aves por réplica con 3 aves por jaula). Las gallinas fueron alimentadas con una dieta de maíz y harina de soja suplementada con 4000 UI/kg de VD (grupo control), 50 g/kg de 25-OHD y 2000 UI/kg de VD (grupo experimental 1), o 50 g/kg de 25-OHD y 4000 UI/kg de VD (grupo experimental 2) durante 12 semanas. Los resultados demostraron que el 25-OHD causó un aumento significativo en la tasa de puesta, especialmente en el grupo de 50 g/kg de 25-OHD + 2000 UI/kg de VD; la tasa de puesta alcanzó el máximo en comparación con otros grupos después de 12 semanas (< 0.05). Sin embargo, no hubo efectos significativos en el peso promedio del huevo, la ingesta diaria promedio de alimento o la relación alimento-huevo (> 0.05). Una suplementación dietética de 50 g/kg de 25-OHD y 2000 UI/kg de VD proporcionó una mejor resistencia de la cáscara del huevo, altura del albumen espeso y unidad Haugh después de 12 semanas (< 0.05). Un análisis adicional de los índices sanguíneos mostró que la alanina aminotransferasa, la aspartato aminotransferasa, la fosfatasa alcalina, el calcio y el fósforo se mejoraron significativamente en el grupo de 50 g/kg de 25-OHD + 2000 UI/kg de VD, mientras que el contenido de bilirrubina total disminuyó significativamente (< 0.05). Además, la adición de 25-OHD en las dietas mejoró los contenidos de calcio y fósforo en el suero (< 0.05). Las concentraciones de 25-OHD, hormonas paratiroideas, hormona foliculoestimulante y progesterona aumentaron en el grupo de 50 g/kg de 25-OHD + 2000 UI/kg de VD, y los niveles de cortisol, calcitonina, proteína gla ósea y endotoxina en el suero alcanzaron un mínimo en el grupo de 50 g/kg de 25-OHD + 4000 UI/kg de VD (< 0.05), lo que constituye una ventaja para las gallinas ponedoras envejecidas. Las actividades de las enzimas antioxidantes y las capacidades de eliminación de radicales libres en el grupo de 50 g/kg de 25-OHD + 2000 UI/kg de VD aumentaron notablemente, y el nivel de MDA disminuyó significativamente en el grupo de 50 g/kg de 25-OHD + 4000 UI/kg de VD (< 0.05). Las mejoras en la morfología yeyunal y la integridad intestinal resultaron en un aumento de la relación longitud de vellosidades a profundidad de criptas en el grupo de 50 g/kg de 25-OHD + 2000 UI/kg de VD (< 0.05). Las adiciones dietéticas de 50 g/kg de 25-OHD y 2000 UI/kg de VD mejoraron la calidad de la tibia, incluyendo el peso fresco de la tibia, la resistencia, el contenido mineral (Ca) y el área de las trabéculas (< 0.05). En conjunto, en comparación con la adición dietética de VD, la suplementación dietética de 25-OHD apoyó un estado fisiológico estable para una producción sostenida de huevos, calidad del huevo y calidad ósea en gallinas ponedoras en fase tardía, y los niveles de adición de 50 g/kg de 25-OHD y 2000 UI/kg de VD tuvieron el mejor efecto. Por lo tanto, esto podría proporcionar una base teórica para el uso de 25-OHD como sustituto del VD.