Los pollos de engorde se crían comúnmente en sistemas de alojamiento cerrado con exposición limitada a la luz solar, dependiendo así completamente de fuentes dietéticas de vitamina D. El metabolito hidroxilado 25-hidroxicolecalciferol [25(OH)D] se ha propuesto como una forma más potente que la vitamina D nativa (colecalciferol). Este estudio evaluó los efectos de la suplementación dietética con vitamina D sola o en combinación con 25(OH)D sobre el rendimiento de crecimiento, las características óseas y la microbiota cecal en pollos Ross 308. Un total de 952 pollitos machos de un día fueron asignados a cuatro tratamientos: un control negativo (sin vitamina D), un control positivo (vitamina D según las especificaciones de Ross 308) y un control positivo suplementado con 25(OH)D a 1394 o 2788 IU/kg, en un diseño aleatorizado con 17 réplicas por tratamiento y 14 aves por réplica. Durante un ensayo de alimentación de 40 días, las dietas que contenían vitamina D (control positivo) o suplementadas con 25(OH)D mejoraron significativamente el peso corporal final, el aumento de peso, el aumento diario promedio y la relación de conversión alimenticia en comparación con el control negativo (< 0.01), sin diferencias significativas entre el control positivo y los grupos suplementados con 25(OH)D, con una clara respuesta lineal dependiente de la dosis. Aunque el contenido de cenizas de la tibia y la resistencia a la fractura ósea no se vieron significativamente afectados, las respuestas lineales indicaron una ligera tendencia numérica hacia una mejor mineralización esquelética con el aumento de 25(OH)D. El análisis de la microbiota indicó que 25(OH)D afectó la ecología microbiana cecal: la inclusión de dosis bajas mostró una reducción en la riqueza y uniformidad de especies, mientras que la inclusión de dosis altas restauró la riqueza a niveles comparables al control positivo y enriqueció los taxones asociados con la fermentación de fibra y el metabolismo de ácidos biliares, mientras que redujo la dominancia. En conclusión, la suplementación con 25(OH)D además de vitamina D mejoró el rendimiento de crecimiento y moldeó selectivamente la microbiota cecal de los pollos, con beneficios sugerentes para la mineralización ósea. Estos hallazgos destacan a 25(OH)D como una fuente más potente de vitamina D que el colecalciferol solo y apoyan su uso práctico en la nutrición moderna de pollos de engorde para mejorar la eficiencia, la salud esquelética y el equilibrio microbiano.