Treinta vacas lecheras Holstein en lactancia fueron asignadas aleatoriamente en un diseño emparejado para evaluar los efectos de una dieta basal (CON) frente a la misma dieta basal suplementada con 60 g/d de lisina protegida en el rumen y 30 g/d de metionina protegida en el rumen (RPLM) tanto en condiciones de estrés por calor (HS) como en condiciones de no estrés por calor (NHS). La suplementación con RPLM mejoró significativamente la digestibilidad aparente de la materia seca, la proteína cruda y la fibra detergente neutra. Durante el período de HS, la concentración de nitrógeno amoniacal en el rumen disminuyó, mientras que las concentraciones de TVFA, acetato y butirato aumentaron notablemente. El análisis de secuenciación de 16S rRNA reveló que la suplementación con RPLM enriqueció los taxones bacterianos productores de butirato, particularmente los cuales mostraron una correlación positiva con la digestibilidad de nutrientes. Estos hallazgos indican que RPLM mejora la estructura microbiana del rumen y la eficiencia en la utilización de nutrientes, mitigando así las alteraciones digestivas inducidas por el estrés por calor.