La suplementación con ácido benzoico (BA) en la alimentación animal puede reducir la capacidad de unión a ácidos de los piensos, inhibir el crecimiento de bacterias patógenas, mejorar la digestión de nutrientes y aumentar las actividades enzimáticas intestinales. Este estudio tuvo como objetivo investigar los efectos de diferentes dosis de BA en el rendimiento de crecimiento, la fermentación del rumen y la microbiota del rumen de terneros lecheros Holstein destetados. Treinta y dos terneros Holstein de 60 días de edad fueron asignados aleatoriamente a cuatro grupos (n = 8): un grupo de control (alimentado con una dieta basal sin suplementación de BA; grupo CON) y grupos que fueron suplementados con 0.25% (grupo LBA), 0.50% (grupo MBA) y 0.75% (grupo HBA) de BA a la dieta basal (en base a materia seca), respectivamente. El experimento duró 42 días, comenzando a los 60 días de edad y finalizando a los 102 días de edad, con el destete ocurriendo a los 67 días de edad. La suplementación con BA aumentó linealmente el aumento diario promedio de peso de los terneros lecheros destetados, que fue significativamente mayor en los grupos LBA, MBA y HBA que en el grupo CON. La ingesta diaria promedio de alimento aumentó cuadráticamente con la suplementación de BA, alcanzando su punto máximo en el grupo MBA. La suplementación con BA disminuyó linealmente la relación alimento-aumento (F/G), pero no afectó los parámetros de fermentación del rumen, excepto por la proporción molar de butirato e iso-butirato, que aumentaron linealmente con la dosis de suplementación de BA. En comparación con el grupo CON, las proporciones molares de iso-butirato en los grupos LBA, MBA y HBA y la de butirato en el grupo HBA fueron significativamente mayores que las del grupo CON. La suplementación con BA no tuvo un efecto significativo en la diversidad alfa y beta de la microbiota del rumen, pero aumentó significativamente las abundancias relativas de bacterias beneficiosas, como , y redujo las de las bacterias dañinas, como y , en el rumen. El análisis de predicción funcional utilizando la base de datos MetaCyc reveló variaciones significativas en las vías asociadas con la glucólisis entre los grupos, incluyendo las vías GLYCOLISIS-TCA-GLYOX-BYPASS, GLYCOL-GLYOXDEG-PWY y P105-PWY. En conclusión, la suplementación con BA mejoró la composición y función de la microbiota del rumen, elevó la producción de butirato e iso-butirato, y aumentó el rendimiento de crecimiento de los terneros lecheros Holstein destetados.