Los vesículos extracelulares (EVs) son pequeños vesículos lipídicos liberados por células procariotas y eucariotas, involucrados en la comunicación intercelular, la inmunomodulación y la patogénesis. En este estudio, realizamos una caracterización de los EVs producidos por trofozoítos de un aislado clínico de la ameba de vida libre. Se analizaron la distribución de tamaños, el potencial zeta, el perfil proteico y la actividad de proteasas. Bajo nuestras condiciones de incubación, se observaron EVs de diferentes tamaños, con una población predominante que varía de 206 a 227 nm. El SDS-PAGE reveló bandas de proteínas de 25 a 260 KDa. La presencia de proteínas antigénicas fue confirmada por Western blot, que evidenció un reconocimiento más fuerte por anticuerpos policlonales de rata generados contra la región cercana a 80 KDa e incluyó peptidasas, como se reveló por zymografía. Las proteínas en bandas inmunoreconocidas seleccionadas fueron identificadas adicionalmente utilizando nano-ESI-MS/MS. Un perfil proteómico preliminar de los EVs identificó al menos 184 proteínas como parte de la carga de los vesículos. Los ensayos de actividad de proteasas, en combinación con el uso de inhibidores, revelaron la predominancia de proteasas serinas. La presente caracterización descubre la complejidad de los EVs producidos, sugiriendo su posible relevancia en la liberación de factores de virulencia involucrados en la patogenicidad. Debido a la diversidad de su carga, investigaciones adicionales sobre los EVs podrían revelar nuevos objetivos terapéuticos o biomarcadores para desarrollar herramientas de diagnóstico rápidas y precisas para infecciones letales como la causada por esta ameba.