Los sistemas genéticos reversos para virus de ARN son plataformas para introducir mutaciones en los genomas de ARN y así han ayudado a comprender su ciclo de vida y aprovecharlos para propósitos humanos, como desarrollar vacunas y sistemas de entrega. Estos sistemas se basan en el ADN complementario (cADN) de los virus de ARN, cuyas transcripciones derivadas de las polimerasas de ARN bacterianas actúan no solo como el ARNm primario para la síntesis de proteínas de fagos, sino también como la plantilla para las ARN replicasas de fagos (también conocidas como polimerasas de ARN dependientes de ARN). Aquí presentamos un protocolo optimizado para los pequeños fagos de ARN (es decir, levifagos) que infectan . Este protocolo incluye tres pasos fundamentales: (i) Creación de un cADN fusionado con un promotor, (ii) generación de un clon en un vector basado en mini-Tn, y (iii) introducción del clon en hospederos no susceptibles. Como ejemplo representativo, describimos el sistema genético reverso para PP7, que infecta un conjunto de cepas como PAO1. El cADN fue fusionado al promotor T7, el cual fue clonado en mini-TnGm. Este constructo fue introducido en PAK y HB101. El ensamblaje funcional de los fagos PP7 a partir de los sobrenadantes de cultivo fue evaluado mediante la formación de placas en PAO1 y las partículas de fago fueron observadas bajo microscopio de transmisión. Encontramos que las células hospederas deben ser cultivadas a 30 grados Celsius para la máxima producción de fagos (~10 pfu/mL). Los sistemas genéticos reversos proporcionarán una nueva visión del ciclo de vida de los fagos de ARN y ayudarán a desarrollar variantes modificadas con nuevas características para aplicaciones de fagos en cuanto a diagnóstico selectivo y terapia eficiente.