Las rifamicinas son una clase de agentes antibacterianos extremadamente importantes cuya acción resulta de la inhibición de la síntesis de ARN dependiente de ADN. Un arreglo especial de grupos hidroxilo no sustituidos en C21 y C23, con átomos de oxígeno en C1 y C8, es esencial para la actividad. Además, se sabe que la acción antibacteriana de la rifamicina se pierde si alguno de los dos grupos hidroxilo anteriores sufre sustitución y ya no está libre para actuar en la inhibición enzimática. En el presente trabajo, describimos el uso exitoso de una reacción Alder-Ene entre Rifamicina O y dietilo azodicarboxilato, que resultó en la introducción dirigida de un grupo relativamente voluminoso cerca de C21 para proteger su grupo hidroxilo. Se encontró que muchos diésteres azo relacionados reaccionaron de manera análoga, dando un producto predominante en cada caso. Para determinar de manera inequívoca la estereoquímica del proceso de adición Alder-Ene, se preparó un derivado zwitteriónico cristalino del aducto de dietilo azodicarboxilato mediante amina reductora en su centro espiraloide C4. El aducto, como un solvato de mono cloroformo, cristalizó en el grupo espacial ortorrómbico no centrosimétrico Sohnke, 222. Se describe la conformación única y la estereoquímica absoluta reveladas a través del análisis de la estructura cristalina por rayos X.