El ictus es la principal causa de muerte con más de 5 millones de fallecimientos en todo el mundo cada año. Cerca del 80% de los ictus son ictus isquémicos causados por coágulos sanguíneos. El activador del plasminógeno tisular (tPa) es el único medicamento aprobado por la FDA para tratar el ictus isquémico con un precio al por mayor de más de $6000. El tPa ya no está patentado, aunque no se ha desarrollado ningún biosimilar. La producción de tPa se ve complicada por los 17 enlaces disulfuro que existen en el tPA plegado correctamente. Aquí presentamos una plataforma de síntesis de proteínas sin células basada en - para la expresión de tPa e informamos sobre las condiciones que dieron lugar a la producción de tPa activo. Aunque la actividad es inferior a la del tPa disponible comercialmente, este trabajo demuestra el potencial de los sistemas de expresión sin células para la producción de futuros biosimilares. El sistema de expresión sin células basado en - se está convirtiendo cada vez más en una plataforma atractiva para la producción de biosimilares de bajo costo debido a los recientes avances que permiten la producción a partir de reactivos liofilizados estables en estantería, la eliminación de endotoxinas de los reactivos para prevenir el riesgo de shock endotóxico y la producción rápida a pedido en horas.