La carboxilasa de fosfoenolpiruvato (PEPC) desempeña roles centrales en la fotosíntesis, la respiración, la síntesis de aminoácidos y el desarrollo de semillas. PEPC está regulada por diferentes modificaciones post-traduccionales. Entre ellas, la fosforilación por PEPC-quinasa (PEPCk) está ampliamente documentada. En este trabajo, silenciamos simultáneamente los tres genes de sorgo que codifican PEPCk (Sb-) mediante interferencia de ARN, obteniendo 12 líneas transgénicas independientes, mostrando diferentes grados de silenciamiento de Sb. Entre ellas, se seleccionaron dos líneas homocigotas T2 para una evaluación adicional. La expresión de Sb se redujo en un 65% y un 83% en hojas iluminadas, respectivamente. La expresión de Sb fue mayor en raíces y disminuyó en un 50% en este tejido. La expresión de Sb fue baja y altamente variable. A pesar del silenciamiento incompleto del gen, se redujo el grado de fosforilación de PEPC en hojas iluminadas, plantas deficientes en P y plantas tratadas con NaCl. Tanto las hojas como las semillas de las líneas presentaron perfiles metabólicos alterados y una disminución general en el contenido de aminoácidos. Además, las líneas mostraron un retraso en la floración, y el 20% de las plantas no produjeron flores en absoluto. La cantidad total de semillas se redujo en un 50% y un 36% en las líneas, respectivamente. La calidad de las semillas fue inferior en las líneas: menor contenido de aminoácidos, incluyendo Lis, y mayor contenido de fitato. Estos datos confirman la relevancia de la fosforilación de PEPC en el desarrollo del sorgo, las respuestas al estrés, el rendimiento y la calidad de las semillas.