La técnica de sexado de esperma es favorecida en la industria láctea. Esta investigación se centra en la eficiencia del sexado de esperma bovino utilizando la separación celular activada por magnetismo (MACS) mediante un anticuerpo scFv contra espermatozoides portadores del cromosoma Y (Y-scFv) acoplado a microesferas magnéticas y sus efectos en variables cinemáticas, calidad del esperma y la relación X/Y de espermatozoides. En este estudio, la concentración óptima de acoplamiento del anticuerpo Y-scFv a la superficie de las microesferas magnéticas fue de 2-4 mg/mL. Las microesferas PY revelaron espermatozoides portadores del cromosoma Y (Y-espermatozoides) significativamente enriquecidos en la fracción elutada (78.01-81.43%) y espermatozoides portadores del cromosoma X (X-espermatozoides) en la fracción del sobrenadante (79.04-82.65%). La calidad del esperma sexado congelado y descongelado fue analizada mediante CASA y citómetro de flujo de imagen, que mostró que las microesferas PY no tuvieron un efecto negativo en la motilidad, viabilidad o integridad del acrosoma de los X-espermatozoides. Sin embargo, los Y-espermatozoides sexados presentaron una motilidad y viabilidad significativamente disminuidas. La relación X/Y de espermatozoides se determinó utilizando un citómetro de flujo de imagen y PCR en tiempo real. Las microesferas PY produjeron esperma con hasta un 82.65% de X-espermatozoides en la fracción enriquecida en X y hasta un 81.43% de Y-espermatozoides en la fracción enriquecida en Y. El sexado de esperma bovino mediante microesferas PY mostró alta eficiencia en la separación de Y-espermatozoides de X-espermatozoides y calidad aceptable del esperma. Esta técnica inicial es factible para el sexado de esperma bovino, lo que aumenta el número de novillas en los rebaños lecheros mientras reduce los gastos de producción.