La segmentación es uno de los pasos más importantes en el análisis de imágenes de microscopía. Desafortunadamente, la mayoría de los métodos utilizan imágenes de fluorescencia para esta tarea, lo cual no es adecuado para análisis que requieren un conocimiento del área ocupada por las células y un diseño experimental que no permite el etiquetado necesario. En este protocolo, presentamos un método simple, basado en la detección de bordes y operaciones morfológicas, que separa el área total ocupada por las células del fondo utilizando solo la imagen del canal de luz brillante. La imagen segmentada resultante puede ser utilizada posteriormente como una máscara para la cuantificación de fluorescencia y otros análisis. Todo el procedimiento se lleva a cabo en el software de código abierto Fiji.