La secuenciación metagenómica es una herramienta valiosa para detectar de manera no específica varios microorganismos en muestras, ofreciendo ventajas únicas para detectar patógenos emergentes, patógenos exigentes o no cultivables, y infecciones mixtas. Recientemente se ha aplicado para detectar clínicamente microorganismos patógenos en animales; sin embargo, la alta proporción de genes del huésped, el costoso equipo de secuenciación y la complejidad de los métodos de secuenciación y análisis de datos han limitado su utilidad clínica. En este estudio, se empleó una combinación de homogeneización de tejidos y digestión con nucleasas para eliminar los genes del huésped de muestras de cerdo y gato; luego se extrajeron ADN y ARN y se sometieron a amplificación PCR no selectiva para detectar simultáneamente los genomas de patógenos de ADN y ARN utilizando celdas de flujo R9.4.1 o R10.4.1 en la plataforma MinION. La detección de patógenos en tiempo real se llevó a cabo utilizando EPI2M WIMP, y la ensamblaje de genomas virales se realizó utilizando NanoFilt, minimap2, samtools e ivar. Se examinaron patógenos en cinco muestras clínicas (suero, hisopo nasofaríngeo, heces o ascitis) de gatos y cuatro muestras clínicas (tejido pulmonar o del intestino delgado) de cerdos mediante secuenciación metagenómica, y los resultados fueron consistentes con los obtenidos por PCR y cultivo bacteriano. Además, detectamos cuatro virus y tres bacterias que pueden estar asociados con enfermedades. Una comparación de los resultados antes y después de la eliminación de genes del huésped en tres muestras mostró una reducción del 9-50% en los genes del huésped. También comparamos la eficiencia de ensamblaje de seis genomas virales y encontramos que volúmenes de datos que oscilan entre 3.3 y 98.3 MB eran suficientes para ensamblar más del 90% de los genomas virales. En resumen, este estudio utilizó métodos de secuenciación metagenómica y análisis optimizados por nanoporo para reducir los genes del huésped, disminuir el volumen de datos requerido para el análisis de secuenciación y permitir la detección en tiempo real para determinar cuándo detener la secuenciación. El proceso de secuenciación y análisis simplificado supera las barreras para la aplicación clínica veterinaria de la secuenciación metagenómica y proporciona una referencia para la implementación clínica.