(1) Antecedentes: Los búfalos de agua son importantes para la producción de leche y carne. Hasta ahora, el análisis genómico se ha centrado en sujetos femeninos, dejando el cromosoma Y esencialmente desconocido. Los avances en la secuenciación de tercera generación (TGS) han hecho posible mejorar el estudio de secuencias genómicas complejas, como las de los búfalos y otras especies de mamíferos, incluidos los humanos. (2) Métodos: En este estudio, aplicamos la secuenciación de lectura larga basada en TGS para generar, en un solo paso, secuencias de genoma completo de alta calidad, que pueden aprovechar al máximo un rápido pipeline bioinformático, como el descrito en el artículo complementario. (3) Resultados: Se han secuenciado completamente cinco genomas de búfalos machos a una profundidad relativamente alta (20-40x), que, combinada con la longitud de lectura típica de TGS, proporciona la base para importantes conocimientos sobre rasgos genéticos específicos de machos, incluidos aquellos vinculados a la producción de carne y leche. (4) Conclusiones: Con el uso de tecnologías TGS, ofrecemos una estrategia completa para la secuenciación rápida de genomas en un solo paso que también puede aplicarse a otros animales de granja con un genoma comparativamente grande. Este enfoque puede ayudar a revelar características genéticas propias de un individuo animal más allá de la simple evaluación de un número de SNPs u otras variaciones de secuencia conocidas, apoyando así una mejor selección genética para la productividad láctea y futuras investigaciones sobre la variabilidad genética en razas de búfalos.