El virus de la fiebre porcina africana (ASFV), el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), el virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) y el virus de la pseudorrabia porcina (PRV) son patógenos importantes que circulan en los rebaños de cerdos en muchos países. Los cerdos infectados con estos virus muestran signos similares, como aumento de la temperatura corporal y pérdida de apetito, y son propensos a síntomas respiratorios, síntomas digestivos, síntomas neurológicos y/o aborto en cerdas gestantes. Para detectar con precisión estos virus y diagnosticar diferencialmente estas enfermedades, se diseñaron cuatro pares de cebadores específicos y sondas TaqMan dirigidas al gen (p72) de ASFV, la región 5" no traducida de CSFV, el gen de PRRSV y el gen de PRV. Después de optimizar las condiciones de reacción, se desarrolló un ensayo de RT-PCR cuantitativa en tiempo real multiplex (RT-qPCR) para la detección diferencial de ASFV, CSFV, PRRSV y PRV. El ensayo fue validado además para probar 3116 muestras clínicas, y las tasas de positividad de ASFV, CSFV, PRRSV y PRV fueron del 10.84% (338/3116), 0.80% (25/3116), 14.92% (465/3116) y 1.38% (43/3116), respectivamente. El ensayo proporciona un método altamente específico, sensible y reproducible para la detección de ASFV, CSFV, PRRSV y PRV.