La soja es la principal fuente de aceite y proteína para la mayor parte de la población mundial. A medida que la población crece, también lo hace la demanda de soja. Sin embargo, la sequía es un factor importante que limita la producción de soja. Regular la respuesta de la soja al estrés por sequía utilizando cloruro de mepiquat (MC) es un método viable; sin embargo, su mecanismo aún no está claro. Este estudio utilizó PEG-6000 para simular el estrés por sequía y técnicas de proteómica cuantitativa para revelar cambios en Heinong44 (HN44) y Heinong65 (HN65) sometidos a sequía tras la aplicación de 100 mg/L de MC. Los resultados mostraron que la SOD en HN44 no cambió significativamente, pero disminuyó un 22.61% en HN65 después del tratamiento con MC, y el contenido de MDA disminuyó un 22.75% y un 21.54% en HN44 y HN65, respectivamente. Además, MC mejoró el ciclo GSH-ASA y simultáneamente promovió el proceso del ciclo de Calvin para permitir que la planta mantuviera una cierta tasa de asimilación de carbono bajo estrés osmótico. Además, MC reguló al alza algunas proteínas durante la gluconeogénesis y el metabolismo del almidón y aumentó el contenido de azúcares solubles en un 8.41% en HN44. MC también redujo la abundancia de proteínas ribosómicas, afectando la traducción y el metabolismo de aminoácidos. En resumen, MC mejoró el ciclo GSH-ASA y el ciclo de Calvin bajo estrés para aliviar el daño oxidativo y mantener el crecimiento de los cultivos. Nuestro estudio es el primero en informar sobre el mecanismo de regulación de MC en la soja bajo estrés osmótico, proporcionando nuevas perspectivas para la aplicación racional de MC en la soja.