(1) Antecedentes: Las roturas de doble cadena (DSBs) en un solo núcleo se miden generalmente utilizando la prueba de estructura de cromatina de esperma (SCSA), la prueba de dispersión de cromatina de esperma (SCD) y la prueba de cometas (CA). Se desarrollaron la electroforesis en gel de campo pulsado de una sola célula en una dimensión (1D-SCPFGE) y la electroforesis en gel de campo pulsado de una sola célula en dos dimensiones modulada por ángulo (2D-SCPFGE) para observar la fragmentación del ADN en espermatozoides móviles separados. (2) Métodos: Se establecieron estándares comparativos, curvas de calibración, niveles de sensibilidad requeridos y criterios de elegibilidad para el esperma de prueba para validar los principios de medición de estas pruebas. (3) Resultados: Los métodos convencionales pasaron por alto la interferencia de las nucleoproteínas en sus mediciones. La proteólisis en gel mejora la precisión de las mediciones de 1D- y 2D-SCPFGE. El ADN desnudo es adecuado para estándares comparativos y muestras de prueba. Además, se observan varias disfunciones que podrían inducir daño en el ADN en los espermatozoides móviles separados. En general, la discusión destaca la necesidad de revisar los análisis univariables convencionales basados en la SCSA, la prueba SCD y la CA. (4) Conclusiones: La infertilidad humana es un síndrome complejo, y el objetivo del control de calidad en la inyección intracitoplasmática de esperma es identificar las disfunciones subyacentes que permanecen en los espermatozoides móviles separados que los hacen inelegibles para la inyección. Se necesitan análisis multivariables con especial consideración a los factores de confusión en futuros estudios de cohortes.