Los aceites esenciales (AE) han ganado popularidad en las últimas décadas entre los investigadores debido a su potencial para reemplazar los productos químicos convencionales utilizados en la lucha contra plagas, microbios patógenos y de deterioro, y procesos de oxidación. Los AE son mezclas complejas con muchos componentes químicos, cuyo contenido depende de muchos factores, no solo del género, especie o subespecie de la planta, sino también del quimiotipo, localidad, condiciones climáticas, fase de vegetación, método de extracción y otros. Debido a este hecho, aún hay mucho por estudiar, siendo el efecto antimicrobiano una de las propiedades clave de los AE. Existen muchos métodos que han sido utilizados frecuentemente por los investigadores para la evaluación in vitro; sin embargo, aunque la investigación ha estado en curso durante décadas, aún falta un estándar aceptado internacionalmente. La mayoría de los métodos se basan en estándares probados a lo largo del tiempo utilizados para la prueba de antibióticos. Debido a las propiedades específicas de los AE y sus componentes, como la volatilidad y la hidrofobicidad, se han adoptado muchas modificaciones de estos procedimientos estándar. El objetivo de esta revisión es describir los métodos más comunes y sus modificaciones para la prueba de propiedades antimicrobianas de los AE y señalar las variables más controvertidas que pueden afectar potencialmente los resultados de los ensayos.