Las notables actividades biológicas de los aceites esenciales de orégano (EOs) han llevado recientemente a una serie de estudios destinados a explorar sus posibles aplicaciones innovadoras en las industrias alimentaria y farmacéutica. Se caracterizó la composición química y las actividades biológicas de los EOs de dos genotipos, cultivados ampliamente en Sicilia y que no habían sido estudiados previamente por sus propiedades biológicas. Se consideraron plantas de los dos genotipos, pertenecientes a los quimiotipos de carvacrol (CAR) y timol (THY) y cultivadas en diferentes entornos de cultivo, para este estudio. Se investigaron los perfiles químicos, incluida la determinación de la distribución enantiomérica, de los EOs, obtenidos por hidrodestilación de hojas y flores secas, mediante GC-MS. La actividad biológica se evaluó como propiedades antimicrobianas contra diferentes cepas indicadoras de patógenos, mientras que la integridad de la barrera intestinal, la reducción de la adhesión de patógenos y las acciones antiinflamatorias se ensayaron en la línea celular intestinal Caco-2. El perfil químico del genotipo CAR fue menos complejo y se caracterizó por niveles más altos del compuesto más activo, es decir, carvacrol, en comparación con el genotipo THY. La distribución enantiomérica de los constituyentes quirales no varió entre los genotipos, mientras que fue marcadamente diferente de la observada en genotipos de otros orígenes geográficos. En general, todos los EOs mostraron alta actividad antimicrobiana, tanto in vitro como en una prueba de desafío en matriz alimentaria. Los EOs representativos de los dos genotipos no alteraron el sellado del monocapa epitelial solo para concentraciones inferiores al 0.02%, fueron capaces de reducir la adhesión de patógenos seleccionados, pero no ejercieron efectos antiinflamatorios relevantes. Estos resultados sugieren su posible uso como agentes de control contra un amplio espectro de patógenos transmitidos por alimentos.