L. (alfalfa), una legumbre perenne, se considera generalmente una fuente valiosa de proteínas para el ganado y está sujeta a pastoreo prolongado y repetido en pastos naturales. Estudiar el mecanismo de respuesta molecular de la alfalfa bajo diferentes tratamientos de pastoreo es crucial para comprender sus rasgos adaptativos y es de gran importancia para cultivar pastos tolerantes al pastoreo. Aquí, realizamos un análisis transcriptómico para investigar los cambios en la expresión génica bajo tres intensidades de pastoreo. En total, se identificaron 4184 genes expresados diferencialmente (DEGs) entre las intensidades de pastoreo probadas. El análisis de la ontología génica (GO) reveló que los genes estaban principalmente enriquecidos en células, procesos celulares, procesos metabólicos y unión. Además, dos vías, la vía de interacción planta-patógeno y la vía de señalización de hormonas vegetales, mostraron un enriquecimiento significativo en el análisis de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG). Se identificaron quinasas de proteínas y factores de transcripción asociados con hormonas e inmunidad vegetal. Los genes relacionados con la inmunidad vegetal se activaron más bajo un tratamiento de pastoreo alto, mientras que más genes relacionados con la regeneración se expresaron bajo un tratamiento de pastoreo ligero. Estos resultados sugieren que la alfalfa exhibe diferentes estrategias para aumentar la resiliencia y la resistencia al estrés bajo diversas intensidades de pastoreo. Nuestros hallazgos proporcionan pistas importantes y direcciones de investigación adicionales para comprender los mecanismos moleculares de las respuestas de las plantas al pastoreo.