La resistencia evolucionada de Houtt. a los herbicidas inhibidores de ALS está bien establecida. Estudios previos se han centrado principalmente en la resistencia en el sitio objetivo; sin embargo, la resistencia en sitios no objetivo no ha sido bien caracterizada. Esta investigación demostró que la secuenciación de genes no detectó ninguna mutación de resistencia conocida previamente en una población resistente a mesosulfuron-methyl (MR), y notablemente, el tratamiento con el inhibidor de monooxigenasa P450 (P450) malatión aumentó marcadamente la susceptibilidad a mesosulfuron-methyl. El análisis de UPLC-MS/MS confirmó un metabolismo elevado de mesosulfuron-methyl en plantas MR. La integración de la secuenciación de isoformas (Iso-Seq) y la secuenciación de ARN (RNA-Seq) facilitó la identificación de genes candidatos asociados con sitios no objetivo en una subpoblación con dos generaciones de selección de herbicidas. A través del análisis de qRT-PCR, se caracterizaron 21 genes expresados diferencialmente, y entre estos, 10 genes (que comprenden tres P450, dos glutatión -transferasas, una glicosiltransferasa, dos transportadores de casete de unión a ATP, una oxidasa y una hidrolasa) mostraron una regulación constitutiva al alza en plantas resistentes. Nuestros hallazgos corroboraron que el aumento del metabolismo de herbicidas es una fuerza impulsora detrás de la resistencia a mesosulfuron-methyl en esta población.