El uso de antimicrobianos en la producción ganadera y su efecto en el desarrollo de la resistencia a los antimicrobianos (RAM) es un problema de salud global para los humanos, los animales y el medio ambiente. El objetivo de este estudio fue determinar los niveles de residuos antimicrobianos en muestras de leche y heces durante el período de retiro en ganado lechero administrado con una sola dosis del fármaco, así como caracterizar los patrones de resistencia antimicrobiana de los cultivos de muestras de heces. En el estudio, se incluyeron vacas lecheras de tres granjas diferentes en Macedonia del Norte. Se recolectaron muestras de leche cruda y heces antes de la administración del fármaco (día 0) y en el 1er, 2º, 3er, 7º y 21º día después de la administración del fármaco. Los residuos antimicrobianos de oxitetraciclina, enrofloxacina, amoxicilina, trimetoprim y procaína-bencilpenicilina se determinaron utilizando un método validado de cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) que involucra isótopos estables. Según los resultados obtenidos, los niveles más altos de residuos antimicrobianos analizados se determinaron el primer día después de la administración del fármaco, que luego disminuyeron gradualmente hasta su eliminación (día 7). La mayor RAM (100%) se encontró en antimicrobianos beta-lactámicos. Menos exposición a antimicrobianos de amplio espectro podría ser un factor importante para la reducción de la RAM en las granjas lecheras.