La interferencia de ARN (RNAi) es un mecanismo regulador y protector que desempeña un papel crucial en el crecimiento, desarrollo y control de las respuestas de las plantas a patógenos y estrés abiótico. En el silenciamiento génico inducido por spray (SIGS), se utilizan ARN de doble cadena exógenos (dsRNA) para regular de manera eficiente los genes objetivo a través del tratamiento de la superficie de la planta. En este estudio, nuestro objetivo fue evaluar el efecto de dsRNAs exógenos específicos en el silenciamiento de diferentes regiones (promotor, codificación de proteínas e intrón) del gen objetivo del tomate, que codifica un represor MYB tipo R3 de la biosíntesis de antocianinas. También evaluamos el impacto de dirigir diferentes regiones sobre la expresión de genes involucrados en la biosíntesis de antocianinas y flavonoides. Este estudio demostró la importancia crítica de seleccionar la región del gen objetivo adecuada para la acción del dsRNA. La mayor inhibición de la expresión génica y activación de la biosíntesis de antocianinas se logró con dsRNA complementario a la región codificante de proteínas del gen, en comparación con dsRNAs que apuntan a las regiones del promotor o intrón. El silenciamiento del gen aumentó el contenido de antocianinas y elevó los niveles de otras sustancias en la vía del fenilpropanoide, como la putrescina cafeoil, el ácido clorogénico, el glucósido de ácido ferúlico, el ácido feruloil quínico y la rutina. Este estudio es el primero en examinar los efectos de cuatro dsRNAs diferentes que apuntan a varias regiones del gen, un importante regulador negativo de la biosíntesis de antocianinas.