Las tasas de elongación o terminación de la traducción en eucariotas son moduladas a través de interacciones moleculares cooperativas que involucran ARNm, el ribosoma, aminoacil- y tARNs polipeptídicos nascentes, y factores de traducción. Para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a estos procesos, desarrollamos un sistema de traducción in vitro a partir de levadura, reconstituido con factores de elongación y terminación de traducción purificados, utilizando ARNm que contiene el IGR IRES de CrPV, el cual funciona en ausencia de factores de iniciación. El sistema es capaz de sintetizar no solo oligopéptidos cortos sino también proteínas reporteras largas como la nanoluciferasa. Al establecer condiciones apropiadas de reacción de traducción, como la concentración de Mg/poliamina, el arresto de la elongación de la traducción por secuencias conocidas de detención del ribosoma (por ejemplo, repeticiones de poliprolina y codones CGA) se recapitula adecuadamente en este sistema. Describimos protocolos para la preparación de los componentes del sistema, la manipulación del sistema y la detección de los productos de traducción. También mencionamos parámetros críticos para establecer las condiciones de reacción de traducción. Este sistema de traducción reconstituido no solo facilita análisis bioquímicos de la traducción, sino que también es útil para varias aplicaciones, como estudios estructurales y funcionales con el objetivo de diseñar fármacos que actúen sobre los ribosomas eucariotas, y el desarrollo de sistemas para producir nuevas proteínas funcionales incorporando aminoácidos no naturales mediante ribosomas eucariotas.