La edición del genoma libre de ADN mediante la entrega directa de nucleasas asociadas a CRISPR ha surgido como una tecnología prometedora debido a su precisión y reducido riesgo de efectos fuera del objetivo. Sin embargo, los protocolos de purificación existentes para las proteínas Cas nativas requieren el uso de instrumentación compleja, lo que limita su aplicación. Aquí presentamos un protocolo simplificado para la purificación de las nucleasas nativas Cas9, Cas12RR y dCas9-VP64 optimizadas para la edición del genoma libre de ADN. Nuestro enfoque aprovecha una cromatografía de afinidad e intercambio iónico simplificada, acoplada con un procesamiento mínimo posterior, asegurando un buen rendimiento y actividad de las proteínas purificadas. El análisis in vitro del complejo ribonucleoproteico purificado demostró una buena eficiencia en la clivaje del objetivo de ADN. Este protocolo simplificado aumenta la oportunidad de adoptar la tecnología CRISPR y permite un acceso más amplio a herramientas de edición del genoma libre de ADN, incluso para laboratorios que no están específicamente equipados para la purificación de proteínas.