El objetivo de este estudio fue investigar la eficacia antimicrobiana de diferentes protocolos de desinfección en un nuevo modelo de biofilm basado en un método de visualización y evaluar la posible alteración de la superficie dentinaria. Un total de 120 premolares humanos extraídos se asignaron a 6 grupos con diferentes protocolos de irrigación. La evaluación de la efectividad de cada protocolo y la alteración de la superficie dentinaria se visualizaron utilizando SEM y microscopía de fluorescencia (DAPI). Un biofilm denso con una profundidad de penetración de 289 um (parte medial del conducto radicular) y 93 um (parte apical) validó que el modelo de biofilm se había implementado con éxito. Se detectó una diferencia significativa entre los grupos de 3% de NaOCl y todos los otros grupos en ambas partes observadas del conducto radicular (< 0.05). Sin embargo, el análisis SEM reveló que la superficie dentinaria en los grupos de 3% de NaOCl estaba severamente alterada. El modelo de biofilm establecido y el método de visualización basado en DAPI son apropiados para la cuantificación bacteriana y la evaluación del efecto de profundidad de diferentes protocolos de desinfección en el sistema del conducto radicular. La combinación de 3% de NaOCl con 20% de EDTA o MTAD con PUI permite la descontaminación de zonas de dentina más profundas dentro del conducto radicular, pero al mismo tiempo altera la superficie dentinaria.