La microdiálisis cuantitativa es una técnica tradicional de determinación de afinidad biofísica. En el desarrollo del detallado protocolo experimental presentado, utilizamos equipos disponibles comercialmente, dispositivos de diálisis de equilibrio rápido (RED) (ThermoFisher Scientific), lo que significa que está al alcance de la mayoría de los laboratorios. La proteína objetivo y el compuesto de prueba se incuban en una cámara dividida para permitir solo que las moléculas pequeñas pasen a una cámara de reservorio más grande, luego se utiliza cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) o cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para determinar la abundancia del compuesto en cada cámara. Una mayor concentración del compuesto medida en la cámara que contiene la proteína objetivo indica unión. Como contribución novedosa y diferenciadora, presentamos un protocolo para el análisis matemático de los datos experimentales. Proporcionamos las ecuaciones y el software para obtener constantes de disociación para el complejo proteína objetivo-compuesto de prueba de hasta 0.5 mM K, y discutimos cuantitativamente las limitaciones de las afinidades en relación con las concentraciones de compuesto medidas.