Durante todas las etapas del desarrollo pulmonar, el mesodermo pulmonar (o mesénquima) está estrechamente relacionado con el endodermo, y su regulación cruzada promueve, controla y dirige todos los procesos de desarrollo pulmonar. La generación de organoides 3D in vitro, ensayos de ARN y estudios de respiración mitocondrial se utilizan para analizar el desarrollo y la regeneración pulmonar con el fin de comprender mejor las interacciones entre el epitelio y el mesénquima, así como para el estudio de alteraciones redox y el estado metabólico de las células. Además, para evitar el uso de líneas celulares inmortalizadas en estos enfoques in vitro, son esenciales las técnicas estandarizadas de aislamiento de fibroblastos pulmonares primarios neonatales murinos. Aquí presentamos un método optimizado para aislar, cultivar y congelar fibroblastos pulmonares primarios de pulmones neonatales. Nuestro método actual incluye instrucciones paso a paso acompañadas de explicaciones gráficas y pasos críticos.