La alfalfa es una leguminosa forrajera reconocida a nivel mundial que ha ganado atención recientemente por su alto contenido de proteínas, lo que la hace adecuada tanto para el consumo humano como animal. Sin embargo, debido a su naturaleza perenne y genética autotetraploide, la cría de plantas convencional requiere un período de tiempo más largo en comparación con otros cultivos. Por lo tanto, la ingeniería genética ofrece una ruta más rápida para la modificación y mejora de rasgos. Aquí, describimos un protocolo para lograr una expresión génica transitoria eficiente en alfalfa a través de la transformación genética con el vector pCAMBIA1304. Este vector contiene los genes reporteros beta-glucuronidasa (GUS) y proteína fluorescente verde (GFP), junto con un gen de fosfotransferasa de higromicina B seleccionable, todos impulsados por el promotor CaMV 35s. Se optimizaron varios parámetros de transformación, como diferentes tipos de explantes, edades de las hojas, tamaños de las hojas, tipos de heridas, concentraciones bacterianas (OD), períodos de precultivo de tejidos, períodos de infección, períodos de co-cultivo y diferentes concentraciones de acetosiringona, nitrato de plata y cloruro de calcio, utilizando plántulas cultivadas in vitro de 3 semanas de edad. Se obtuvieron resultados a partir de datos basados en la observación semicuantitativa del porcentaje y número de manchas de GUS en diferentes días de agro-infección en explantes de alfalfa. El porcentaje más alto de positividad de GUS (76.2%) se observó en explantes de hojas segmentadas de alfalfa, heridas con bisturí y de 3 semanas de edad, después de 3 días de agro-infección a una concentración bacteriana de 0.6, con 2 días de precultivo, 30 minutos de co-cultivo y la adición de 150 uM de acetosiringona, 4 mM de cloruro de calcio y 75 uM de nitrato de plata. La expresión transitoria de genes de interés se confirmó mediante ensayos histoquímicos de GUS y GFP. Los resultados basados en la expresión transitoria del gen reportero sugieren que varios factores influyen en la entrega de T-DNA en la transformación mediada por Agrobacterium de la alfalfa. El protocolo mejorado puede ser utilizado en técnicas de transformación estable para la alfalfa.